Действует с 10 июня 2019 г.
Приложение
Таблица № 1. Критерии эффективности методики идентификации ГМО
| N п/п | Характеристика | Описание характеристики | Критерий | Методы оценки критерия |
| 1 | Специфичность ПЦР | Способность ПЦР-тест-системы выявлять только целевую нуклеиновую кислоту (далее - НК) | ПЦР-тест-система должна выявлять целевую НК. ПЦР-тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять НК близкородственных и неродственных биологических видов, в 100% проводимых исследований | Для оценки специфичности используют контрольные панели образцов. В состав панели входят образцы, содержащие целевую НК и не содержащие целевую НК |
| 2 | Чувствительность ПЦР | Наименьшее содержание копий целевой НК, которое может быть определено с использованием данной ПЦР-методики, в первую очередь зависит от свойств используемых праймеров и зондов | Чувствительность должна быть не ниже 100 копий целевой НК, например, плазмидной, в одной ПЦР | Проводят исследования ряда десятикратных разведений целевой плазмидной НК с известной концентрацией в двух повторах каждое. Определяют максимальное разведение, при котором НК воспроизводимо выявляется (в двух повторах) |
| 3 | Эффективность ПЦР | Характеризует прирост матрицы на каждом цикле амплификации | Эффективность ПЦР должна быть не ниже 90%. Это соответствует значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): не ниже 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1 - 3,6) | Для оценки эффективности ПЦР проводят амплификацию с рядом десятикратных разведений целевой плазмидной НК (пункт 2 настоящей таблицы) в двух повторах каждое. Строят график зависимости Ct от логарифма концентрации НК матрицы. Определяют наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивают по уравнению: Е = [10(-1/slope)]-1 В идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: Е = 100%, (slope = -3,32) |
| 4 | Предел обнаружения ПЦР-тест-системы (LOD) | Отражает минимальное количество биологического искомого объекта в исследуемом образце, которое может достоверно обнаружить данный метод | Чем меньше искомого биологического объекта способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Определяется экспериментально, но должен составлять не более 0,1% | Готовят ряд модельных образцов с разным содержанием целевой матрицы. Готовят образцы целевого ГМО-ингредиента (от 5% до 0,001% содержания) в соответствующей матрице. Исследуют приготовленную панель с использованием ПЦР-методики. Определяют минимальное содержание ГМО-ингредиента в тотальной НК организма, при котором ГМО воспроизводимо выявляется (в десяти повторах) |
| 5 | Предел количественного определения (LOQ) | Наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть оценено с использованием методики с требуемой правильностью и внутрилабораторной прецизионностью | Для методик ГМО предел должен быть не более 0,1%. На пределе чувствительности относительное стандартное отклонение (RSD) для методик ГМО не должно превышать 20%. Истинное значение измеряемой величины должно входить в полученный при измерениях доверительный интервал | Исследуют 10 повторов 0,1% ГМО-стандарта по ПЦР-методике. Рассчитывают среднее значение содержания ГМО в образце и относительное стандартное отклонение (RSD). Сравнивают рассчитанное стандартное отклонение (RSD) с критерием 20%. Также оценивают, входит ли истинное значение в доверительный интервал полученного среднего значения |
| 6 | Аналитическая область (dynamic range) | Интервал определяемых аналитических характеристик, в котором получаемые результаты имеют приемлемый уровень правильности и прецизионности. Для ГМО-методик обычно приемлем диапазон 0,1% - 5% | Диапазон 0,1% - 5% ГМО экспериментальных данных, должен удовлетворять линейной модели (пункт 7 настоящей таблицы) | Проводят исследования образцов с различным содержанием ГМО. Оценивают линейность зависимости аналитического сигнала |
| 7 | Линейность | Наличие линейной зависимости аналитического сигнала в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Оценивается как R²- коэффициент корреляции, определяющий верность модели линейной зависимости Ct от логарифма концентрации калибровочных образцов | R² - коэффициент для калибровочных образцов должен быть не менее 0,98% | Исследуют в двух повторах 0,1%, 1,0% и 5,0% калибровочные ГМО-стандарты по ПЦР-методике. Строят калибровочную прямую (dCt от lgC), оценивают коэффициент корреляции данных с линейной зависимостью (R²) |
| 8 | Правильность | Правильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное | Методика дает корректные результаты, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике | Готовят образцы из калибровочных стандартов 0,1%, 1,0% и 5,0% с добавлением матриц различного происхождения (для этого смешивают стандарты с другими ингредиентами, сухим молоком, мясным фаршем, рыбной мукой). Исследуют образцы по ПЦР-методике в двух повторах. Оценивают, входит ли истинное значение в диапазон погрешности полученного среднего значения для каждого образца |
При использовании методики, основанной на ПЦР, исследование включает последовательные процессы: подготовку проб, выделение нуклеиновых кислот из образцов, амплификацию заданных фрагментов нуклеиновых кислот, детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результатов.
Таблица № 2. Основные маркерные и селективные гены, являющиеся составляющими частями генно-инженерных конструкций
| Мишень | Описание |
| Ген LacZ | Кодирует фермент b-галактозидазу. Используется в векторных плазмидных конструкциях (pCR2.1 ТОРО, pVIK112, pBSKSII и других), включает область полилинкера для клонирования рекомбинантных генов. При наличии данного фермента бесцветный субстрат X-gal превращается в окрашенный продукт, бактериальные колонии, экспрессирующие LacZ, имеют голубой цвет |
| Ген gfp | Ген зеленого флуоресцентного белка используется в ряде векторных плазмид для генно-инженерных манипуляций (pKEN-gfpmut2, pRK415-gfp) в качестве светящейся метки |
| Ген amp | Кодирует устойчивость к ампициллину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322, pUC18, pBSKSII, рЕТ, pCR2.1 ТОРО) |
| Ген Km | Кодирует устойчивость к канамицину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pVIK112, pMC212) |
| Ген tetO | Кодирует устойчивость к тетрациклину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322) |
| F1 ori | Ориджин репликации плазмид (pBSKSII, pKEN-gfpmut2, pCR2.1 TOPO) |
| Транспозон Tn7L | Фрагмент обеспечивает транспозицию рекомбинантных генов из плазмид в геном (pRK415-gfp) |
| Ген ermC | Кодирует устойчивость к эритромицину, плазмидные векторы |
| Ген cat | Кодирует устойчивость к хлорамфениколу, плазмидные векторы |
| R6K ori | Ориджин репликации плазмид (pVIK112) |
Таблица № 3. Критерии эффективности методики полногеномного секвенирования
| Этап анализа | Характеристика | Описание характеристики | Критерий |
| Подготовка библиотеки для | Концентрация геномной ДНК | Не менее 0,2 нг/мкл | |
| секвенирования | Размер фрагментов ДНК | Распределение фрагментов по длинам, устанавливается электрофоретически | Распределение в диапазоне 250 - 1000 п.н. Максимум распределения 300 - 500 п.н. |
| Проведение массового параллельного секвенирования | Распределение качества идентификации нуклеотидов | Q= -10log10p, где р - вероятность неправильного определения нуклеотида | Q > 20, то есть вероятность ошибки не более 0,01 |
| Среднее качество прочтения | Q > 25 | ||
| Служебные последовательности | Наличие служебных последовательностей (адаптеров, индексов) в прочтении | Должны отсутствовать | |
| Покрытие чтения | Число чтений, содержащих определенный нуклеотид последовательности генома | Не менее десятикратного покрытия | |
| Представленность нуклеотидов в каждом цикле | Максимальное отклонение между А и Т или G и С | Не более 20% в любой позиции | |
| GC-состав на прочтение | Сумма отклонений от ожидаемого распределения | Не более 30% прочтений |